Hämeenlinna

Kaivokatu 16
13100 Hämeenlinna
Y-tunnus: 0499964-0

Puh. 03 615 370 Fax. 03 682 2039

Espoo

Sinimäentie 10 C
02630 Espoo

Oulu - Huollon toimipiste

Aapistie 7 B
90220 Oulu

Tilaukset, tuotetiedustelut sekä muut tiedustelut: info@immunodiagnostic.fi

Ota yhtettä Tekninen tuki ja huolto
Siirry sisältöön

Blogikirjoitussarja: NGS-perusteet, osa 2

NGS-perusteet blogikirjoitussarjan toisessa osassa käydään läpi eri NGS-applikaatioita. Ensimmäinen osa keskittyy käytännön labratyön esittelyyn, kolmannessa osassa selvitellään auki NGS-applikaatioissa käytettyjä ja etenkin sekvensointiajoon liittyviä parametrejä ja termejä. Neljännessä osassa selvitän mitä tarkoittavat UDI:t (Unique Dual indices) ja UMI:t (molecular tags/barcodes) ja miten ne eroavat toisistaan.

Mitä voidaan sekvensoida?

Sekvensointiapplikaatioita on lukuisia, joissa kaikissa on oma workflow/protokollansa:

DNAseq

Koko genomin sekvensointi (whole genome sequencing WGS): Antaa nukleotiditason kuvan koko genomista (n.90%) ja mahdollistaa kaikkien genomisten muutosten analysoinnin. Vaikka koko genomin sekvensoinnin kustannukset ovat tulleet paljon alaspäin, on se edelleen hinnakasta potilastasolla, ja esim. diagnostiikassa haasteena on suuri datamäärä ja satunnaislöydökset.

Eksomisekvensointi

Whole Exome Sequencing, WES on kohdennettua sekvensointia, jossa analysoidaan vain proteiineja koodaavat genomialueet, eli eksonit (kattavat n. 1% genomisesta materiaalista). Kustannustehokkaampaa kuin WGS. Eksomisekvensoinnilla etsitään esim. uusia tautigeenejä ja tauteja aiheuttavia genomisia muutoksia. Eksomisekvensointi on jo kliinisessä käytössä ja sitä voidaan hyödyntää esim. jos potilaalla on epätyypillinen taudinkuva.

Kohdennettu sekvensointi

Targeted-seq/Targeted Gene Capture -Geenipaneelit: valikoitu yhdistelmä geenejä ja mutaatioita. Geenipaneelien sekvensoinnissa näytteet valmistetaan kaupallisilla kiteillä, joilla genominen DNA pilkotaan ja halutuilta genomin alueilta peräisin olevat fragmentit rikastetaan NGS-sekvensointia varten (hybridisaatiopohjaiset paneelit). Multiplex-PCR-pohjainen geenipaneeli on puolestaan poimittu kirjasto, johon on sisällytetty jopa tuhansia amplikoneja yhteen PCR-reaktioon. Tällöin fragmentaatiota ja end-repairia ei tarvitse tehdä vaan sekvensointiadaptorit voidaan liittää suoraan PCR-fragmentin päihin. Amplikonikirjastomenetelmä on nopea, workflow kokonaisuudessaan jopa alle 2h ja soveltuu yhden nukleotidin muutosten sekä lyhyiden insertioiden ja deleetioiden analysoimiseen. Tarjolla on esim. syöpäpaneeleja ja paneeleja on mahdollista toteuttaa myös täysin räätälöityinä custom-versioina.

RNA-sekvensointi

RNA-transkriptien eli geeneistä ilmentyvien osien sekvensointi. Applikaatioita mm. koko transkriptomin analysointi, lähetti- eli mRNA:n sekvensointi (poly-A-hännällisten eli polyadenyloitujen transkriptien rikastus ja tunnistus), alleeli-spesifinen ekspressio, splice varianttien ja eri RNA-isoformien tunnistus, pienten RNA-molekyylien tunnistus yms. paljon muita (GRO-seq, CLIP-seq, Cap-seq, Ribo-seq).

Epigenetiikka; ChIP-Seq, Methyl-Seq

Kromatiini-immunopresipitaatioon perustuvassa ChIP-Seqissä tutkitaan proteiini-DNA-interaktioita; erityisesti transkription aloituskohtia. Muita applikaatioita FAIRE-seq, ATAC-seq. Esimerkki ChIP-seqiin soveltuvasta Dna-kirjastokitistä
DNA:n metylaatiokohtien tutkiminen on myös mahdollista NGS:n avulla: saatavilla on Methyl-Seq-kirjastokittejä, ja ratkaisuja joilla bisulfiittikäsitelty DNA pystytään valmistamaan kirjastoksi mahdollisimman tehokkaasti, jopa single cell -tasolla.

 

Jäikö jokin askarruttamaan? Kysy ja jutellaan lisää!